“細(xì)胞質(zhì)控”教您如何真正養(yǎng)好細(xì)胞!

正如人有喜怒哀樂，細(xì)胞也是如此，細(xì)胞的活力和狀態(tài)是不斷變化的，而非一成不變的。在細(xì)胞體外培養(yǎng)的過程中，離開機(jī)體保護(hù)的細(xì)胞是很脆弱的，在陌生的生長環(huán)境下即便是培養(yǎng)條件的輕微改變，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生無法預(yù)估的影響。在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中，即使保持培養(yǎng)條件*一致，在傳代過程中，細(xì)胞的存活質(zhì)量也是逐漸下降的。

以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC細(xì)胞）為例，HUVEC細(xì)胞是研究內(nèi)皮細(xì)胞功能的經(jīng)典體外細(xì)胞模型。在心血管疾病的研究中，主要用于研究內(nèi)皮細(xì)胞功能改變或損傷后其衍生細(xì)胞因子對血壓的影響；在腫瘤研究中，主要用于實(shí)體瘤中血管生成的研究。然而，HUVEC在傳代培養(yǎng)過程中，其活力是逐漸衰退的，因此細(xì)胞傳代多不超過10代。

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)主要是通過顯微鏡下形態(tài)學(xué)變化以及傳代培養(yǎng)周期的變化預(yù)估細(xì)胞生長生存狀態(tài)。這種主觀判斷既無法量化，也無法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。因此，目前對細(xì)胞存活質(zhì)量的判斷并沒有準(zhǔn)確、客觀的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，并且對體外培養(yǎng)細(xì)胞的存活質(zhì)量控制往往被科研工作者們“忽略”，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定。

體外細(xì)胞的有效培養(yǎng)新概念——“細(xì)胞質(zhì)控”。通過細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及DNA損傷五方面對細(xì)胞生長生存狀態(tài)進(jìn)行的監(jiān)控。

在這五個方面中，影響大的便是細(xì)胞活力，下面咱們專門來談一談細(xì)胞活力如何判斷。在體外細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，細(xì)胞總有一些因各種原因而死亡，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比，即是我們常說的細(xì)胞活力。“細(xì)胞質(zhì)控”中基礎(chǔ)的指標(biāo)便是細(xì)胞活力。常見的流式細(xì)胞設(shè)備及部分細(xì)胞計數(shù)儀器都可以對細(xì)胞進(jìn)行jue對計數(shù)，還可以提供準(zhǔn)確、客觀的細(xì)胞活力數(shù)據(jù)，為“細(xì)胞質(zhì)控”提供準(zhǔn)確、客觀的統(tǒng)計學(xué)依據(jù)，細(xì)胞活力評估并不困難！

只要滿足以下兩個條件就可以進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，正常細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一種核酸染料，常用于細(xì)胞凋亡(apoptosis)或細(xì)胞壞死(necrosis)的檢測和流式細(xì)胞儀分析。PI不能通過正常完整的細(xì)胞膜，故細(xì)胞在處于壞死或晚期凋亡時細(xì)胞膜被破壞，這時可為PI著紅色，可以用來分辨壞死細(xì)胞/正常細(xì)胞。

加入另一種可以透過細(xì)胞膜的核酸染料，就可以通過兩種染料將活細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分開。

PI經(jīng)常被用來與Calcein-AM或者FDA等熒光探針一起使用，能同時對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色。PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535 nm和615 nm。

細(xì)胞活力的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)界定

應(yīng)用案例：納米藥物毒性測試

納米藥物的研究是近年來新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。納米藥物載體篩選的首要標(biāo)準(zhǔn)是檢測其對細(xì)胞的毒性。而在細(xì)胞毒性測試中，首先要排除的是基底培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的死細(xì)胞，即“噪音信號”。在對新型納米藥物載體SEONLA的研究中，Zaloga等人認(rèn)為只有活細(xì)胞比例超過90%方可進(jìn)行細(xì)胞毒性研究，細(xì)胞質(zhì)控的重要性由此可見一斑。

細(xì)胞毒性的入門級指標(biāo)是細(xì)胞活力。判斷一種物質(zhì)（化合物、小分子藥物或蛋白質(zhì)等）對細(xì)胞的毒性首先要觀察的是其是否或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，即細(xì)胞活力的變化。以維生素C為例，研究發(fā)現(xiàn)，高濃度維生素C對眼癌細(xì)胞Y79 Retinoblastoma Cells具有殺傷作用。文章中，作者以眼癌常用化療藥Melphalan作為對照，對經(jīng)過處理的細(xì)胞活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的升高，維生素C對Y79 Retinoblastoma Cells殺傷作用逐漸增強(qiáng)，并且維生素C對眼癌細(xì)胞的殺傷作用優(yōu)于Melphalan。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為眼癌更安全、更有效的治療方案的提出提供了理論依據(jù)。

除了細(xì)胞毒性研究，細(xì)胞質(zhì)控在病毒感染或者RNA轉(zhuǎn)染的研究中也是非常重要的。在這一類研究中，轉(zhuǎn)染/感染試劑或多或少都會對細(xì)胞已有一定殺傷作用。因此，在轉(zhuǎn)染之前，活細(xì)胞需要達(dá)到一定的比例才可以保證在轉(zhuǎn)染之后有足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的研究。而這一比例需要實(shí)驗(yàn)條件摸索才能確定。