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蒂科生物2018春季血清* WB標(biāo)準(zhǔn)protocol
2018-03-21 瀏覽次數(shù)：1444
蒂科生物2018春季血清* WB標(biāo)準(zhǔn)protocol
蒂科生物2018春季血清*，成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：
1凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進(jìn)行分析
2吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進(jìn)行分析
3處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上
4處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測
蒂科生物2018春季血清*，成功進(jìn)行WB檢測，則設(shè)置合適正確的對照是*的，只要正確設(shè)置了這些對照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在，并保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對照如下：
l 陽性對照：明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的工作效率
l 陰性對照：明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的特異性
l 二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
l 內(nèi)參對照：檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
l 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果
蒂科生物2018春季血清*，WB檢測基本過程
1、獲取細(xì)胞或組織裂解物
1)根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
蛋白位置 | 推薦buffer |
全細(xì)胞 | NP-40 or RIPA |
胞漿（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
胞漿（骨架結(jié)合蛋白） | Tris-Triton |
膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
線粒體蛋白 | RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標(biāo)本制備的質(zhì)量
2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準(zhǔn)確性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay,Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白
3、電泳分離蛋白質(zhì)
蒂科生物2018春季血清*，根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件：
待測蛋白狀態(tài) | 凝膠條件 | 上樣buffer | 電泳buffer |
Reduced - Denatured | 還原，變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
Reduced - Native | 還原，不變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
Oxidized - Denatured | 不還原，變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
Oxidized - Native | 不還原，不變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
蛋白分子量（kDa） | 凝膠濃度（％） |
4-40 | 20 |
12-45 | 15 |
10-70 | 12.5 |
15-100 | 10 |
25-200 | 8 |
4、轉(zhuǎn)膜
根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性，選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：
| PVDF膜 | NC膜 | 尼龍膜 |
靈敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
背景 | 低 | 低 | 較高 |
蛋白結(jié)合能力 | 100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結(jié)合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
機(jī)械強(qiáng)度 | 強(qiáng) | 干的膜易脆 | 軟而結(jié)實 |
溶劑抗性 | 強(qiáng) | 差 | 差 |
使用前是否需要浸潤 | 100%甲醛潤濕 | 緩沖液潤濕 | 緩沖液潤濕 |
適用染色方法 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用陰離子染料 |
適用檢測方法 | 顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測 | 顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性 | 顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性 |
適用范圍 | 普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質(zhì)測序、氨基酸分析、重復(fù)檢測 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重復(fù)檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 | 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用 |
價格 | 高 | 較低 | 低 |
5、封閉
去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：
l 選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗證）
l 選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
l 選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體
一抗的保存和使用：
l 根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。
l 抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周
l 根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進(jìn)行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實驗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。
l 孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據(jù)抗體親和力不同孵育時間有所區(qū)別
7、二抗孵育
根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8、底物孵育
選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量
9、結(jié)果分析和檢測
凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片
Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進(jìn)行洗滌，3次，每次5min
蒂科生物2018春季血清*，WB技術(shù)要點和常見問題分析
WB過程中常見的問題及可能原因分析
問題 | 可能原因 | 驗證或解決辦法 |
轉(zhuǎn)膜不充分 | 膜沒有*均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
靶蛋白分子量小于10,000 | 選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間 | |
靶蛋白等電點等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值 | 可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液 | |
甲醇濃度過高 | 過高甲醇濃度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 | |
轉(zhuǎn)移時間不夠Thick gel | 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間 | |
背景高 | 膜沒有*均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數(shù) | |
阻斷不充分 | 增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | |
二抗?jié)舛冗^高 | 降低二抗?jié)舛?/span> | |
檢測過程中膜干燥 | 保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象 | |
曝光過度 | 縮短曝光時間 | |
抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng) | 檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng) | |
沒有陽性條帶 | 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
酶失活 | 直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 | |
標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。 | |
試劑不匹配 | 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性 | |
一抗失效 | 選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液 | |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊N化Na | |
有陽性條帶，但條帶比較弱 | 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
酶活性降低 | 直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 | |
標(biāo)本中靶蛋白含量太低 | 增加標(biāo)本上樣量。 | |
洗膜過度 | 縮短洗滌時間 | |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊N化Na | |
抗體活性降低 | 選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間放置 | |
蛋白轉(zhuǎn)移不充分 | 見上述 | |
封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型 | |
曝光時間過短 | 延長曝光時間 | |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊N化Na | |
條帶位置（大小）不對；或有非特異性條帶 | 二抗的非特異性結(jié)合 | 增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對重鏈的） |
一抗的特異性不夠 | 使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 | |
蛋白降解 | 使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑 | |
二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度 | |
抗體濃度過高 | 降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶 | |
蛋白上樣量過大 | 降低上樣量 | |
背景有斑點 | 封閉劑中有聚集體 | 使用前過濾封閉試劑 |
HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
膜上出現(xiàn)反像（暗背景上白色帶） | HRP含量過高 | 降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
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